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探针法PCR的原理步骤
28 人阅读发布时间：2025-12-01 14:40
原理简述
探针法PCR（如TaqMan法）在常规PCR引物的基础上，加入一条带有荧光报告基团和淬灭基团的特异性探针。当探针完整时，荧光被淬灭；在PCR延伸阶段，Taq酶的5'→3'外切酶活性会水解与模板结合的探针，使荧光基团与淬灭基团分离，从而释放荧光信号。荧光强度随PCR产物累积而增强，实现实时定量。
探针法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种用于检测和定量特定DNA序列的方法，其步骤包括：
1、试剂准备
将冻干粉试剂离心后加入复溶缓冲液，涡旋混匀后分装保存。每个反应体系通常为20µl，包含预混液、引物和探针。
2、PCR反应
模板DNA或cDNA与引物、探针混合，加入含Taq酶的预混液。
程序设置：变性（94-95℃）、退火（50-65℃）、延伸（72℃），循环数一般不超过45次。
荧光信号在退火或延伸阶段采集，与扩增产物量成正比。
3、结果分析
通过Ct值（荧光信号达到阈值的循环数）定量目标基因，标准曲线用于绝对定量分析。
探针法qPCR因其高特异性和敏感性，广泛应用于基因表达分析、基因分型、病原体检测等领域。
探针法PCR（如TaqMan法）在常规PCR引物的基础上，加入一条带有荧光报告基团和淬灭基团的特异性探针。当探针完整时，荧光被淬灭；在PCR延伸阶段，Taq酶的5'→3'外切酶活性会水解与模板结合的探针，使荧光基团与淬灭基团分离，从而释放荧光信号。荧光强度随PCR产物累积而增强，实现实时定量。
探针法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种用于检测和定量特定DNA序列的方法，其步骤包括：
1、试剂准备
将冻干粉试剂离心后加入复溶缓冲液，涡旋混匀后分装保存。每个反应体系通常为20µl，包含预混液、引物和探针。
2、PCR反应
模板DNA或cDNA与引物、探针混合，加入含Taq酶的预混液。
程序设置：变性（94-95℃）、退火（50-65℃）、延伸（72℃），循环数一般不超过45次。
荧光信号在退火或延伸阶段采集，与扩增产物量成正比。
3、结果分析
通过Ct值（荧光信号达到阈值的循环数）定量目标基因，标准曲线用于绝对定量分析。
探针法qPCR因其高特异性和敏感性，广泛应用于基因表达分析、基因分型、病原体检测等领域。