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ELISA实验结果的准确性和重复性如何保证？
16 人阅读发布时间：2025-11-25 09:25
为确保ELISA实验结果的准确性和重复性，需从操作规范、样本与试剂管理、质控与验证三方面进行系统优化。以下是具体措施：
一、操作规范优化
1、加样与温育
使用校准后的移液器，避免气泡或交叉污染；严格遵循说明书控制温育时间（如37℃±0.5℃）。
封板需严密，防止阳性样本蒸发导致“花板”现象。
2、洗涤与显色
洗涤需彻底（建议5-6次，每次静置30秒），以降低背景噪音。
显色剂（如TMB）需临用前配制，避光操作，显色时间不宜过长。
3、避免“钩状效应”
高浓度样本可能因抗原过剩导致假阴性，需通过稀释或选择高动态范围试剂盒解决。
二、样本与试剂管理
1、样本质量控制
避免溶血、细菌污染及反复冻融；血清样本中类风湿因子（RF）可通过热灭活（56℃ 30分钟）处理。
样本稀释时，稀释剂应尽可能与样本基质相似（如含BSA的PBS）。
2、试剂选择与保存
选择高特异性抗体对（至少一种为单克隆抗体），并通过配对筛选确保信噪比。
试剂避免反复冻融，分装保存以维持活性；使用前需平衡至室温。
三、质控与验证
1、质控指标监测
回收率应在80%-120%之间，稀释线性偏差需在80%-120%内，以评估样本基质干扰。
板内变异系数（CV）应<5%，板间CV<15%，确保结果稳定性。
2、对照设置
包括阴性对照（空白孔、样本阴性对照）和阳性对照（标准品或阳性样本），验证试剂活性。
3、设备与环境控制
定期校准酶标仪波长（如450nm）和移液器精度，保持实验室温湿度稳定。
四、常见问题处理
高背景信号：优化封闭条件（延长封闭时间）、调整抗体浓度、严格洗涤。
信号缺失：检查试剂活性、孵育时间及温度，避免样本含抑制剂。
通过以上优化措施，可显著提升ELISA实验的准确性和重复性。
一、操作规范优化
1、加样与温育
使用校准后的移液器，避免气泡或交叉污染；严格遵循说明书控制温育时间（如37℃±0.5℃）。
封板需严密，防止阳性样本蒸发导致“花板”现象。
2、洗涤与显色
洗涤需彻底（建议5-6次，每次静置30秒），以降低背景噪音。
显色剂（如TMB）需临用前配制，避光操作，显色时间不宜过长。
3、避免“钩状效应”
高浓度样本可能因抗原过剩导致假阴性，需通过稀释或选择高动态范围试剂盒解决。
二、样本与试剂管理
1、样本质量控制
避免溶血、细菌污染及反复冻融；血清样本中类风湿因子（RF）可通过热灭活（56℃ 30分钟）处理。
样本稀释时，稀释剂应尽可能与样本基质相似（如含BSA的PBS）。
2、试剂选择与保存
选择高特异性抗体对（至少一种为单克隆抗体），并通过配对筛选确保信噪比。
试剂避免反复冻融，分装保存以维持活性；使用前需平衡至室温。
三、质控与验证
1、质控指标监测
回收率应在80%-120%之间，稀释线性偏差需在80%-120%内，以评估样本基质干扰。
板内变异系数（CV）应<5%，板间CV<15%，确保结果稳定性。
2、对照设置
包括阴性对照（空白孔、样本阴性对照）和阳性对照（标准品或阳性样本），验证试剂活性。
3、设备与环境控制
定期校准酶标仪波长（如450nm）和移液器精度，保持实验室温湿度稳定。
四、常见问题处理
高背景信号：优化封闭条件（延长封闭时间）、调整抗体浓度、严格洗涤。
信号缺失：检查试剂活性、孵育时间及温度，避免样本含抑制剂。
通过以上优化措施，可显著提升ELISA实验的准确性和重复性。