操作ELISA试剂盒时铺板的技巧有哪些？

       ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种高灵敏度、高特异性的免疫学检测方法，广泛用于科研和临床检测中蛋白、抗体或抗原的定量分析。其中，“铺板”是实验的关键起始步骤，直接影响后续反应的均一性与结果可靠性。铺板不仅包括加样，还涉及试剂准备、孔板处理、孵育控制等多个环节。掌握正确的操作技巧，能显著降低假阳性、假阴性及数据波动风险。

þ关键操作技巧与注意事项

1.加样技巧

使用多道移液器：当样本量大时，推荐使用多道移液器（排枪），可显著提高加样速度和一致性，减少人为误差。

加样角度与位置：移液枪头应倾斜，避免接触孔底或孔壁，防止刮伤包被层；液体应加在孔底中央，避免溅起气泡。

控制加样时间：所有样本和标准品应在 5–10分钟内完成加样，避免因预孵育时间不一致导致结果偏差。

更换枪头：每吸取一个样本或试剂后必须更换枪头，防止交叉污染。

2.试剂与样本处理

试剂平衡至室温：所有试剂（尤其是酶标抗体、标准品）在使用前需在 18–25℃平衡30–60分钟，避免冷凝水影响反应。

标准品稀释规范：标准品应现配现用，采用倍比稀释法，在Eppendorf管中完成，禁止在板内直接稀释，以保证梯度准确性。

样本预处理：血清/血浆样本应避免溶血、脂浊或细菌污染，否则可能引起非特异性显色或假阳性。

3.孵育与防蒸发

密闭孵育环境：孵育时将酶标板置于铺有湿布的密闭盒内，或加盖封板膜，防止液体蒸发导致蛋白浓度升高。

严格控制时间与温度：严格按照说明书设定孵育时间和温度（如37℃ 60分钟），误差控制在±5分钟内更佳。

避免干燥：洗板后应立即进行下一步操作，防止酶标板干燥导致蛋白失活。

4.洗涤操作（手工洗板）

洗涤液配制：使用含0.05%–0.2%吐温20的PBS缓冲液，现配现用，20倍稀释浓缩液时需确保结晶完全溶解。

洗涤步骤：

甩尽孔内液体；

每孔加入350μL洗涤液，注满但不溢出；

浸泡1–2分钟，甩干；

重复3–5次；

拍干时力度适中，避免拍断板条。

避免交叉污染：拍板时不要让一个孔的液体溅入另一孔，手工洗板时静置15–30秒再甩干。

5.显色与读数

避光显色：加入底物后需避光反应，防止TMB等底物提前分解。

定时观察：每隔10分钟观察颜色变化，若前几孔已明显显色，可提前加入终止液，避免过强信号导致OD值超出线性范围。

及时检测：加终止液后应在15分钟内完成OD值读数，防止颜色漂移。

6、建议

每次实验做标准曲线：确保定量准确性，且应使用新鲜配制的标准品溶液。

设立对照孔：包括空白孔（只加稀释液）、阴性对照、阳性对照，有助于判断实验有效性。

剩余试剂保存：未用完的酶标板应密封后于2–8℃保存，避免受潮降解。

优先使用洗板机：若条件允许，建议使用自动洗板机，可减少手工误差和背景干扰。