原代细胞计数的操作步骤

原代细胞(primary cell)：是指从机体的组织(如人组织、小鼠组织、大鼠组织和兔组织等)经蛋白酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。

一、原代细胞计数 

1. 将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 

2. 将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 

3. 静置3分钟。 

4. 镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 

    细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000 

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。 

二、原代细胞活力 

1. 将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 

2. 加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 

3. 吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。 

4. 镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。 

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。 

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。 

三、MTT法测细胞相对数和相对活力 

活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。 

1. 细胞悬液以1000rpm离心10分钟，弃上清液。 

2. 沉淀加入0.5－1ml MTT，吹打成悬液。 

3. 37℃下保温2小时。 

4. 加入4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。 

5. 1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计570nm比色，酸化异丙醇调零点。 

注意：MTT法只能测定原代细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。 

附：

1、0.4%台盼兰染液配制： 

    台盼兰 0.4克 加双蒸水至100 ml。 

2、MTT配制： 

    MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。 

3、酸化异丙醇配制： 

    异丙醇中加入HCl使zui终达0.04mol/L。