PCR 由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成。

准备好各种试剂和 PCR 仪，就可以开始 PCR 实验：将各种试剂混合并按照说明书设置 PCR 反应。一般 PCR 循环如下：

1、起始步骤：这对于热启动 PCR 而言是必须的，将反应混合液加热至 94~98 ℃ 以激活 DNA 聚合酶。这一步的时间取决于所选用的 DNA 聚合酶。

2、变性步骤：DNA 本身是双链结构，而 DNA 扩增需要引物与单链 DNA 模板相结合。在这一步，反应混合液被加热至 94～98 ℃ 保持 20～30 秒以破坏双链间的氢键以便释放出单链 DNA。这是 PCR 循环中的第一步。

3、退火步骤：变性之后，DNA 模板以单链的形式在反应混合液中存在。因为反应体系中的引物与 DNA 模板互补，当反应温度降至 50~65 ℃ 时，引物与互补的序列形成氢键。退火温度主要取决于引物的 Tm 值，通常比引物 Tm 值低 3～5 ℃。这一步通常维持 20～40 秒，而聚合酶会结合至引物-模板双链处开始 DNA 合成。

4、延伸步骤：在这一步，DNA 聚合酶开始 DNA 合成，因此这一步的温度选取的是 DNA 聚合酶的最优温度。通常我们选用 72 ℃，但某些 DNA 聚合酶的最适温度是 68 ℃。这一步与体内的 DNA 复制很相似：DNA 聚合酶按照碱基互补规律将 dNTPs 加到引物的 3’ 末端最终得到新的 DNA 双链片段。延伸时间取决于目的 DNA 片段的长度和 DNA 聚合酶的合成能力。一般而言 DNA 聚合酶每 60 秒能够合成 1 kb 长度的 DNA。

5、循环：第 2 步至第 4 步称为一个循环。每次循环之后 DNA 的量均是前一次的两倍。通常一次 PCR 反应进行 30~35 个循环。在前几轮的 PCR 循环过程中 PCR 产物的量以指数速率增长，但是到了反应后期随着 dNTPs 和引物的量的减少以及 DNA 聚合酶的失活，反应速率逐渐下降，因此 PCR 反应的产量也受到了限制。

6、最后的延伸步骤：当 30~35 个循环结束后，我们通常会以 68~74 ℃ 延伸 5~10 分钟，这是希望使反应体系中残留的单链 DNA 全部反应完毕。

7、保存温度：通常我们设置 4~10 ℃ 为反应后 PCR 产物的保存温度。

每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau) 所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。PCR 的反应动力学 PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。

反应最终的 DNA 扩增量可用 Y=(1+X)n 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数，X 表示平均每次的扩增效率，n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。

反应初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现「停滞效应」，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。

PCR 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链 5’ 端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的。

以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的 DNA 为模板，引物是从 3’ 端开始延伸，其 5’ 端是固定的，3’ 端则没有固定的止点，长短不一，这就是「长产物片段」。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链 (即「长产物片段」) 结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的 5’ 端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段 3’ 端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的「短产物片段」。

「短产物片段」是按指数倍数增加，而「长产物片段」则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得 PCR 的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检测用。