诱导干细胞分化形成神经细胞及鉴定

摘要：弃去诱导培养皿中的诱导液, PBS缓冲液清洗, 10%中性甲醛固定细胞10 min, 油红O浸染10 min。60%洗去多余染液, PBS缓冲液清洗细胞10 min, 显微镜下观察并拍照。
参照Shiroi等的方法。弃诱导液, PBS缓冲液清洗细胞, 加DTZ染色液, 染色30 min, PBS缓冲液清洗多余染料, 拍照。换加诱导液继续培养, 5 h后, 着色细胞红色消失, 细胞仍正常生长。 DTZ能与胰岛β细胞富含的Zn2+ 特异性络合, 阳性细胞呈棕红色。源于成年大鼠的胰岛作DTZ染色阳性对照。
弃诱导液, PBS缓冲液清洗细胞, 其中, 6孔中分别加入1 mL含5 mmol/L葡萄糖的无糖-DMEM刺激液(低糖刺激液), 另外6孔分别加入1 mL含25 mmol/L葡萄糖的无糖-DMEM刺激液 (高糖刺激液), 培养2 h。分别收集每孔细胞培养液, 2 000 r/min离心10 min, 收集上清液。采用ELISA法测定胰岛素和C-肽分泌量。
当干细胞生长至单层时, 诱导组换加含有10% NBS、 5 mg/mL大鼠脑组织提取液(本实验室制备)、4 g/L HEPES和3.7 g/L NaHCO3的H-DMEM诱导液, 诱导培养8 d。荧光免疫染色。阴性对照为无糖-DMEM、 10% NBS扩增培养的单层上皮样干细胞。
取健康的SD成年大鼠, 腹腔注射, 麻醉致死。解剖大鼠, 无菌取全脑, 称重。PBS缓冲液清洗, 匀浆器研磨, 加入 10 mL PBS缓冲液稀释, 3 000 r/min离心10 min。收集上清液, 再10 000 r/min离心10 min。重复2次。收集上清液, 0.22 μm滤膜过滤, 制备大鼠脑组织提取液。分装, –20 °C冷冻保存。
诱导培养第8 d, 当观察到典型的神经样细胞时, 弃诱导液, PBS缓冲液清洗, 4%固定细胞15 min。PBS缓冲液清洗, 1% Triton X-100穿透30 min, 1% BSA封闭45 min。PBS缓冲液清洗, 加含1% BSA的PBS缓冲液稀释的兔抗大鼠NSE(1?100稀释), 4 °C过夜。PBS缓冲液清洗, 加含1% BSA的PBS缓冲液稀释的山羊抗兔荧光二抗(1?1 000稀释), 室温避光孵育1 h, PBS缓冲液清洗, 观察并拍照。
扩增干细胞的方法同1.3.1。当干细胞生长至单层, 换加含有10% NBS、1 μmol/L DXM、1 μg/L胰岛素、0.5 mmol/LIBMX、4 g/LHEPES 和3.7 g/L NaHCO3的H-DMEM诱导液, 诱导培养28 d。每7 d进行油红O染色。阴性对照为无糖 -DMEM、 10% NBS扩增培养的单层上皮样干细胞。