间接法ELISA的实验步骤

       间接法ELISA（Indirect ELISA）是一种酶联免疫吸附试验（ELISA）的方法，主要通过检测样品中目标抗体的存在。间接法ELISA广泛应用于抗体效价检测、单抗筛选以及临床上的定性检测等场景。
间接法ELISA的核心是通过酶标二抗放大信号检测目标抗体，其标准流程如下：
一、抗原包被
1、包被液：使用包被液（如CBS缓冲液）将抗原稀释到合适的浓度。
2、包被过程：将稀释后的抗原加入96孔板中，每孔100μL，4℃放置过夜（12小时以上），使抗原与孔板结合。
3、抗原用量：通常为0.1μg×100N/抗原浓度（N为板数）。
二、封闭
为了减少非特异性结合，需要封闭未结合的位点。加入5% BSA或10%脱脂奶粉溶液，37℃孵育1小时，之后同样用0.05% PBST缓冲液洗涤五次，确保彻底去除封闭剂。
三、‌样本孵育‌
加入稀释后的待测样本（如血清，通常1:100-1:200稀释），100 μL/孔，37℃孵育1小时或4℃过夜，使样本中的抗体与抗原结合。
四、一抗孵育
加入与抗原特异性结合的一抗，继续在室温下孵育1小时。之后同样需要洗涤步骤来去除未结合的一抗。
五、二抗孵育
加入酶标二抗，这种二抗是针对一抗宿主物种的，能够与结合在板上的一抗特异性结合。通常使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。孵育时间也是1小时，之后洗涤步骤同上。
六、显色与检测‌
再次洗涤6次，加入底物（如TMB或OPD，100 μL/孔），室温避光孵育5-15分钟，显色后加入终止液终止反应，用酶标仪测定OD值。
七、终止反应
终止液：加入30μL/孔的2mol/L H2SO4终止液，颜色由蓝变黄。
八、数据分析
通过与标准曲线比较，计算出样品中目标抗体的浓度。标准曲线是通过使用已知浓度的抗体标准品进行建立的。
       通过以上步骤，间接ELISA可以有效地检测样品中的抗体或抗原，具有高灵敏度和特异性。‌