细胞冻存操作方法与注意事项

当细胞冷到零度以下时，细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶的大小对细胞有影响是不同的，大冰晶容易造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂，因此就会造成我们复苏出来的细胞存活率、状态等与冻存前的状态相差甚远。解决问题方法以下详述：

一、慢冻细胞

1、常规程序：

使用程序降温盒

当温度在-25℃以上时，1-2℃/min。

当温度在-25℃以下时，5-10℃/min。

当温度达到-100℃时，可迅速转入液氮中。

2、简易程序：

冷冻管管口朝上，放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟下降1-2℃的速度，在40min内降至液氮表面过夜，次晨投入液氮中。

3、传统程序：

冷冻管置于4℃ 10min，-20℃ 30min，-80℃ 16-18h（或隔夜），液氮长期储存。

二、低温保护剂

常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透保护剂，可迅速透入细胞，提高细胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

三、细胞冻存方法

1、预先配制冻存液：

冻存液比例多种，根据细胞的特性进行调整冻存液的比例：

5%—10%DMSO + 20%—90%血清 + 0%—70%基础培养液；

2、取对数生长期的细胞，去除旧培养液，用PBS清洗1-2次；去掉培养瓶里的残余血清；

3、加入适量胰酶（浓度一般为0.25%），使胰酶覆盖整个瓶，放入培养箱消化；

4、细胞消化0.5-2min（具体时间根据镜下形态判断），显微镜下观察细胞，细胞胞质回缩，细胞间不再连接成片，此时加入完全培养基终止消化；

5、用巴氏吸管轻轻吹打细胞，形成细胞悬液，将细胞悬液1000r/min左右条件下离心3-5min；

6、弃上清，加入适量预先配制好的冻存液，巴氏吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中的细胞最终密度为5×106/ml～1×107/ml；

7、将细胞分装入冻存管中，每管1-1.5ml；

8、冻存管标记细胞名称，冻存时间，操作者及细胞代数信息。

对于悬浮细胞冻存，则直接收集离心细胞，除去胰酶消化的步骤，其他步骤相同。

注意事项：

1、需冻存保种的细胞应在生长良好且存活率高，其密度约为80-90％的状态。细胞冻存前应保证细胞的活力好，无污染。

2、在细胞冻存过程中，所结的冰晶对细胞伤害较大，所以过程一定要慢。冻存或者复苏最好用新配制的培养液。