细胞不贴壁问题全面分析解答

    细胞贴壁是细胞（除肿瘤细胞外）在体外培养条件下，完成贴壁后均为单层生长，原因是贴壁细胞有接触性抑制的特点。一般认为接触抑制是细胞间的一种识别作用，对于动物细胞的形态形成与稳定具有重要性的作用。由于贴壁细胞的一面是紧贴在培养瓶上的，如果其上方存在细胞与其相粘附，那么下方的细胞很快就会缺乏营养饿死。

不贴壁的一些原因：
1. 胰酶消化时间把控不当：消化不够细胞本身就是成团的；若胰酶处理太久，容易造成细胞膜蛋白损伤，使细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。
2. 缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子，细胞的贴壁效果会下降很多。
3. 支原体或细菌的污染。
4. 培养液配制、储存不当，如pH值过碱，Gln量太少等原因。
5. 复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性。
6. 接种细胞数目太少，无法分泌足够的细胞外基质。
7. 复苏时处理速度太慢，复苏过程不当。
如何促进细胞贴壁：
1. 适度消化细胞：HepG-2、A549、Hela、SGC-7901几种癌细胞处理时间可适当放长，一般处理5-6min，C2C12、COS-7、NIH-3T3比较容易脱落，2min足矣，P19Cl6和293细胞贴壁不紧，可在PBS漂洗后，直接换新鲜培养基打散。
2. 最好用塑料瓶培养，如果是玻璃瓶,那么可以用鼠尾胶原包被一下培养瓶，或者用盐酸对培养瓶进行蚀刻，或者涂Laminin/fibronectin/collagen/BSA，也可以帮助细胞贴附新的培养瓶，细胞不易贴壁，建议加多聚赖氨酸处理。
3. 正确配制消化液或培养液。
4. 使用合适的细胞外基质或贴壁试剂。
5. 复苏新的细胞，第一周用20%血清帮助细胞复原。
6. 传代接种一定要铺的均匀，避免细胞抱团生长。
7. 细胞传代24小时之内，最好不要晃动，以免影响贴壁。
8. 体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜上，因此培养在有胶原的底物上有利于生长。人或小鼠表皮细胞培养，可以用γ射线照射后的3T3细胞为饲养层，另外降低pH、Ca2+含量和温度，均有利于上皮细胞生长。
细胞不贴壁具体问题解答：
1、细胞的传代最重要的是胰酶处理时间：消化不够细胞本身就是成团的；若胰酶处理太久，容易造成细胞膜蛋白损伤，使细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。
解决办法：缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。
2、缺少贴壁因子：血清中含有促贴壁因子，而无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子，细胞的贴壁效果会下降很多。
解决办法：更换血清。
3、支原体或细菌的污染。
解决办法：分离培养物，检测支原体。清洁支架或培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。
4、培养液配置、储存不当，如 pH 值过碱，Gln 量太少等原因。
解决办法：使用无菌chu 酸溶液调整 pH 值或充入无菌 CO2。
5、复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性。
解决办法：启用新的保种细胞。
6、如果细胞比较珍贵或没有备份细胞
解决办法：可尝试将不贴壁细胞收集离心，再用 PBS 将沉淀清洗一遍，离心后的沉淀加入胰酶重新消化接种，同时提高血清浓度到 15%~20%。