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稳定细胞株筛选的两种方法步骤详述
148 人阅读发布时间：2025-04-02 09:52
稳定细胞株是一种常用于基因表达、药物筛选和蛋白质表达等领域的工具。影响细胞株稳定性的因素非常广泛，例如细胞的类型、表达载体的构建、生产工艺技术和细胞储存等因素都有可能会对细胞株的稳定性产生影响。中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞来源于中国仓鼠(Cricetulus griseus)，是生物制药工业生产重组蛋白药物的选表达系统。超过70%批准上市的重组蛋白药物是在CHO细胞中进行表达生产的，与其他表达系统相比CHO细胞具有以下明显优势。
影响细胞株稳定性的因素:
1、目的蛋白易于表达并被分泌至胞外；
2、具有准确的翻译后修饰功能，表达的外源重组蛋白与天然蛋白生物学特性及理化性质相似；
3、可在无蛋白、无动物源培养基中进行高密度的悬浮培养，利于工业化生产；
4、自身分泌的内源性蛋白较少，利于重组蛋白的分离和纯化。
稳定细胞株的筛选需要经过一系列的步骤和实验，下面介绍一下稳定细胞株筛选的两种方法步骤：
一、质粒转染法
先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，单克隆筛选稳定细胞株；
1、筛选浓度测定，以10~14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度；
2、进行细胞接种，转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80% 覆盖；
3、进行细胞转染；
4、利用质粒上含有的抗性选择进行筛选，并鉴定筛选结果。
二、慢病毒转染法：
应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。慢病毒可以携带外源基因随机整合进基因组。转染得到稳定细胞株的效率高，是建立稳定株的比较不错的方式。
1、将人源化的抗体基因转接到慢病毒载体上，
2、使用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，不同类型病毒包装时间一般在3-5天。
3、用病毒转染目的细胞。包装好的病毒要先测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。
4、后期筛选。转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。
稳定细胞株筛选步骤：
1.构建携带目标基因的载体
首先，需要将目标基因克隆到携带有选择标记的载体中，例如含有抗生素抗性基因的质粒。然后将该载体转染到目标细胞中。
2.选择标记筛选
转染后的细胞需要在含有抗生素的培养基中进行筛选。只有成功转染的细胞才能够在含有抗生素的培养基中生长。
3.稳定细胞株的筛选
在完成了选择标记筛选后，需要对细胞进行进一步的筛选，以得到稳定的细胞株。这可以通过对细胞进行单克隆分离来实现。具体地，将转染后的细胞在96孔板中进行单克隆分离，每个孔只保留一个细胞。然后，通过检测细胞株的表达水平和稳定性，筛选出较佳的稳定细胞株。
总结：
稳定细胞株的筛选是一个复杂的过程，需要仔细设计和实验。通过上述步骤，可以筛选出高表达、稳定的细胞株，为后续的实验和研究提供了有力的支持。
影响细胞株稳定性的因素:
1、目的蛋白易于表达并被分泌至胞外；
2、具有准确的翻译后修饰功能，表达的外源重组蛋白与天然蛋白生物学特性及理化性质相似；
3、可在无蛋白、无动物源培养基中进行高密度的悬浮培养，利于工业化生产；
4、自身分泌的内源性蛋白较少，利于重组蛋白的分离和纯化。
稳定细胞株的筛选需要经过一系列的步骤和实验，下面介绍一下稳定细胞株筛选的两种方法步骤：
一、质粒转染法
先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，单克隆筛选稳定细胞株；
1、筛选浓度测定，以10~14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度；
2、进行细胞接种，转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80% 覆盖；
3、进行细胞转染；
4、利用质粒上含有的抗性选择进行筛选，并鉴定筛选结果。
二、慢病毒转染法：
应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。慢病毒可以携带外源基因随机整合进基因组。转染得到稳定细胞株的效率高，是建立稳定株的比较不错的方式。
1、将人源化的抗体基因转接到慢病毒载体上，
2、使用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，不同类型病毒包装时间一般在3-5天。
3、用病毒转染目的细胞。包装好的病毒要先测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。
4、后期筛选。转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。
稳定细胞株筛选步骤：
1.构建携带目标基因的载体
首先，需要将目标基因克隆到携带有选择标记的载体中，例如含有抗生素抗性基因的质粒。然后将该载体转染到目标细胞中。
2.选择标记筛选
转染后的细胞需要在含有抗生素的培养基中进行筛选。只有成功转染的细胞才能够在含有抗生素的培养基中生长。
3.稳定细胞株的筛选
在完成了选择标记筛选后，需要对细胞进行进一步的筛选，以得到稳定的细胞株。这可以通过对细胞进行单克隆分离来实现。具体地，将转染后的细胞在96孔板中进行单克隆分离，每个孔只保留一个细胞。然后，通过检测细胞株的表达水平和稳定性，筛选出较佳的稳定细胞株。
总结：
稳定细胞株的筛选是一个复杂的过程，需要仔细设计和实验。通过上述步骤，可以筛选出高表达、稳定的细胞株，为后续的实验和研究提供了有力的支持。