- 移动端
上海博湖生物科技有限公司品牌商
8 年
手机商铺
商家活跃：
产品热度：
- NaN
- 0
- 0
- 2
- 2
推荐产品
公司新闻/正文
稳转细胞株构建方法技术分享
910 人阅读发布时间：2024-11-06 13:42
稳转细胞系（稳定表达细胞株）指在细胞中持续稳定表达特定基因或干扰特定基因表达。稳转细胞株的目的基因质粒DNA整合到细胞染色体上，使细胞长期稳定表达该基因。稳转细胞株包括多克隆稳转细胞株和单克隆稳转细胞株。慢病毒感染目的细胞后，通过抗性基因筛选得到的细胞株是多个细胞克隆的组合。单克隆细胞株是从多克隆细胞中经细胞克隆挑选得到的，由一个细胞扩增得到的细胞株。单克隆细胞株性状统一，传代过程中细胞的基因表达保持稳定。
用转染质粒或病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞，根据不同的基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物进行筛选混合阳性克隆。在阳性混合克隆的基础上，得到单细胞长出的阳性单克隆，继而得到稳定转染细胞株。常用的真核表达载体的抗性标志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
慢病毒转染是一种常见的，在一种细胞系中稳定敲除/表达某种基因的方式。稳转株全称是稳定表达细胞株，通常是指基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系，通过慢病毒感染能够将外源 DNA 克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，从而筛选得到可稳定表达目的蛋白或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。
一、稳转细胞植株构建的常备技术方法：
1、基因过表达稳转细胞细胞系构建
（基因过表达多克隆细胞株构建服务、基因过表达单克隆细胞株构建服务）：
因过表达细胞株构建服务包括目的基因过表达慢病毒载体构建、病毒包装、细胞转染和筛选。客户只需提供目的基因的cDNA质粒和需要构建的细胞系，我们将按照您的要求完成目的基因过表达细胞株的构建和检测，提供给您高质量的基因过表达稳定细胞株。
2、RNA基因敲减稳转细胞株筛选
（RNA干扰基因敲减细胞株多克隆构建服务、RNA干扰基因敲减细胞株单克隆构建服务）：
我司的RNAi基因敲减细胞系构建基于慢病毒表达系统，一般采用U6启动子驱动的pLVshRNA-puro或pLVshRNA-EGFP(2A)puro载体构建RNA干扰稳定细胞株，服务内容包括干扰载体构建、靶点筛选、干扰效率验证及稳定细胞筛选和克隆。
3、CRISPR基因敲除稳定细胞株构建服务：
随着TALEN和Cas9/gRNA基因敲除系统的出现，基因定点敲除的难度大幅下降。全新的技术将基因敲除从价格高昂，耗时漫长的ZNF系统，逐渐变成简便的研究工具。现在我们可提供Talen和Cas9/gRNA两个系统的基因敲除服务。包括基因敲除靶点设计，TALEN质粒组装，Cas9/gRNA质粒构建及基因敲除效率验证。
二、稳定细胞株筛选方法：
1、转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系：
对大多数细胞转染效率较低。对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达尚可。但是对于基因干扰实验，对转染效率要求远远高于基因过表达，通常质粒转染无法满足。
另外，质粒游离于细胞质中，很快降解，无法满足较长时间的检测项目；质粒转染整合几率极低，稳定细胞株构建耗时耗力，且得率很低，往往需要挑取单克隆株。
2、病毒感染筛选稳定细胞株：
病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。用慢病毒制备稳转细胞株，由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广，感染效率高，且与细胞染色体整合而不发生基因重排，是制备稳定细胞株的理想载体。
三、稳转细胞株的一般服务流程：
1. 载体构建&病毒包装
一般而言，将人源化的抗体基因转接到慢病毒载体上，然后对质粒表达进行检测，通过包装获得过表达目的基因的慢病毒质粒。慢病毒载体系统的包装成分与载体成分一起转染293细胞进行包装；24至48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后进行滴度测试。
2. 细胞转染
常用的真核表达载体的抗性标志物有嘌呤霉素(Puromycin)、潮霉素(Hygromycin)和新霉素(Neomycin)。首先确定Puromycin/G418的筛选浓度和病毒转染浓度，然后病毒悬液转染细胞24h,Puromycin/G418筛选稳转株，ELISA和WB法鉴定。
3. 单克隆化
使用Molecular ClonePix2系统,高通量、自动化的筛选出100-200个高水平分泌克隆，并从中挑选最佳10个高产克隆，进行下一步的稳定性测试。
4. 细胞系稳定筛选
细胞株多次传代数次后，就有可能会出现遗传不稳定性。我们挑选出最优的10个克隆，进行10次传代后，qPCR和WB法检测细胞株的稳定性。最后我们提供序列及载体报告, 3株表达好的细胞株，表达分析、稳定性测试报告以及详细的稳定细胞株构建报告。
用转染质粒或病毒侵染的方法将构建好的含靶基因的载体导入细胞，根据不同的基因载体中所含的抗性标志选用相应的药物进行筛选混合阳性克隆。在阳性混合克隆的基础上，得到单细胞长出的阳性单克隆，继而得到稳定转染细胞株。常用的真核表达载体的抗性标志物有嘌呤霉素（puromycin）、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
慢病毒转染是一种常见的，在一种细胞系中稳定敲除/表达某种基因的方式。稳转株全称是稳定表达细胞株，通常是指基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系，通过慢病毒感染能够将外源 DNA 克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，从而筛选得到可稳定表达目的蛋白或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。
一、稳转细胞植株构建的常备技术方法：
1、基因过表达稳转细胞细胞系构建
（基因过表达多克隆细胞株构建服务、基因过表达单克隆细胞株构建服务）：
因过表达细胞株构建服务包括目的基因过表达慢病毒载体构建、病毒包装、细胞转染和筛选。客户只需提供目的基因的cDNA质粒和需要构建的细胞系，我们将按照您的要求完成目的基因过表达细胞株的构建和检测，提供给您高质量的基因过表达稳定细胞株。
2、RNA基因敲减稳转细胞株筛选
（RNA干扰基因敲减细胞株多克隆构建服务、RNA干扰基因敲减细胞株单克隆构建服务）：
我司的RNAi基因敲减细胞系构建基于慢病毒表达系统，一般采用U6启动子驱动的pLVshRNA-puro或pLVshRNA-EGFP(2A)puro载体构建RNA干扰稳定细胞株，服务内容包括干扰载体构建、靶点筛选、干扰效率验证及稳定细胞筛选和克隆。
3、CRISPR基因敲除稳定细胞株构建服务：
随着TALEN和Cas9/gRNA基因敲除系统的出现，基因定点敲除的难度大幅下降。全新的技术将基因敲除从价格高昂，耗时漫长的ZNF系统，逐渐变成简便的研究工具。现在我们可提供Talen和Cas9/gRNA两个系统的基因敲除服务。包括基因敲除靶点设计，TALEN质粒组装，Cas9/gRNA质粒构建及基因敲除效率验证。
二、稳定细胞株筛选方法：
1、转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系：
对大多数细胞转染效率较低。对于基因过表达，如果转染效率达到40%，基因过表达尚可。但是对于基因干扰实验，对转染效率要求远远高于基因过表达，通常质粒转染无法满足。
另外，质粒游离于细胞质中，很快降解，无法满足较长时间的检测项目；质粒转染整合几率极低，稳定细胞株构建耗时耗力，且得率很低，往往需要挑取单克隆株。
2、病毒感染筛选稳定细胞株：
病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。用慢病毒制备稳转细胞株，由于其高效整合、高效转录、高效表达、宿主范围广，感染效率高，且与细胞染色体整合而不发生基因重排，是制备稳定细胞株的理想载体。
三、稳转细胞株的一般服务流程：
1. 载体构建&病毒包装
一般而言，将人源化的抗体基因转接到慢病毒载体上，然后对质粒表达进行检测，通过包装获得过表达目的基因的慢病毒质粒。慢病毒载体系统的包装成分与载体成分一起转染293细胞进行包装；24至48小时后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，浓缩后进行滴度测试。
2. 细胞转染
常用的真核表达载体的抗性标志物有嘌呤霉素(Puromycin)、潮霉素(Hygromycin)和新霉素(Neomycin)。首先确定Puromycin/G418的筛选浓度和病毒转染浓度，然后病毒悬液转染细胞24h,Puromycin/G418筛选稳转株，ELISA和WB法鉴定。
3. 单克隆化
使用Molecular ClonePix2系统,高通量、自动化的筛选出100-200个高水平分泌克隆，并从中挑选最佳10个高产克隆，进行下一步的稳定性测试。
4. 细胞系稳定筛选
细胞株多次传代数次后，就有可能会出现遗传不稳定性。我们挑选出最优的10个克隆，进行10次传代后，qPCR和WB法检测细胞株的稳定性。最后我们提供序列及载体报告, 3株表达好的细胞株，表达分析、稳定性测试报告以及详细的稳定细胞株构建报告。