一氧化氮（NO）含量检测试剂盒实验操作流程

     一氧化氮（Nitric Oxide，NO）是一种气态分子自由基，在生物体内作为重要的信使分子和效应分子，参与调节血管形成、神经传递、免疫调控及肿瘤生长等多种生理及病理过程。此外，NO是植物的主要生物活性分子，在植物的生长发育和对胁迫的反应过程中参与了多种生理活动，如种子萌发、叶扩展、根生长、花器官发生、气孔运动的调节以及植物的抗逆反应等。

NO在体内或水溶液中极易氧化生成NO2-。在酸性条件下，NO2-与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物，进一步与萘基C2H4基二胺偶合，产物在550nm处有特征吸收峰，测定其吸光值，可以计算NO含量。

操作步骤：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取0.2g样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆后，10000g，4℃离心15min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为2~5：10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：建议1000万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔7s，总时间 5min），10000g，4℃离心15min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为1000~2000：1的比例进行提取。

③ 血清（浆）等液体样本：直接测定。若液体有浑浊则离心取上清测定。

2、标准溶液的配制：把10μmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成1.25μmol/mL的标准溶液备用。


3、预实验上机操作：
① 酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm。
② 操作表：


4、正式实验：
① 若预实验∆A 测定小于 0.005，可以增加样本量后再进行测定；如果∆A测定大于1.5，建议将样本上清用稀释液适当稀释后再进行测定，并将改变后的W和D代入公式计算；
② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；
③ 正式实验按照预实验操作步骤进行（标准管和空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算
NO含量（μmol/mg prot）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V1÷(V1×Cpr)
= 1.25×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

2、按样本质量计算
NO含量（μmol/g 质量）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V1÷(W×V1÷V)
=1.25×ΔA测定÷ΔA标准÷W

3、按细菌/细胞数量计算
NO含量（μmol/104 cell）=ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V1÷(V1×N÷V)
=1.25×ΔA测定÷ΔA标准÷N

4、按液体体积计算
NO含量（μmol/mL）= ΔA测定×（C标÷ΔA标准）×V1÷V1
= 1.25×ΔA测定÷ΔA标准
C标：标准管浓度，1.25μmol/mL； V1：加入样本体积，0.1mL；
V：加入提取液体积，1mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
W：样本质量，g； N：细菌/细胞总数，以104计。

注意事项：
如果样本上清有颜色（在 550nm 下有吸收峰），则需要补测样本的对照管，即将工作液用相同体积的蒸馏水代替。在 550 nm 下测定吸光值 A，分别记为 A 标准、A 测定、A 空白、A 对照，计算 ΔA 标准=A 标准-A 空白，ΔA 测定=A 测定-A 对照。此时试剂盒规格为 100T/48S。