实时荧光定量PCR（qPCR）探针设计原则及步骤

     实时荧光定量PCR（Real -time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是指在PCR反应体系中加入化学荧光物质，利用荧光信号积累实时监测PCR扩增产物并进行定量分析的方法。根据所用化学荧光物质的不同，qPCR可分为荧光染料法（SYBR Green Ⅰ）和荧光探针法（TaqMan）。SYBR Green Ⅰ染料可以和任何dsDNA结合，缺乏特异性，qPCR反应中若有非特异性扩增产物，会增加荧光值，影响定量结果的准确性，而探针法的出现很好地解决了染料法非特异性的问题。

探针设计原则：

实时荧光定量PCR实验体系的设计对于整个检测的成功非常重要，其中探针的设计是实验的关键，应根据其特性进行设计以适应相应要求。

1、TaqMan探针位置尽可能靠近扩增引物，但不能与引物重叠。

2、TaqMan探针长度一般为25~32 bp之间，最好不要超过40 bp。

3、TaqMan探针的Tm值应比引物的高5~10℃，确保引物延伸时探针完全结合在模板上；引物Tm值通常在60℃左右，探针Tm值通常在65~70℃。

4、TaqMan探针5’端第一个碱基不能是G，因为探针水解酶切后G碱基也能够淬灭荧光基团所发出的荧光信号。

5、避免探针内部形成发夹结构以及探针间三个碱基以上互补，同时避免与引物有三个碱基以上互补。

6、TaqMan探针中C最好比G多，相反则选择其互补链；同时避免单一核苷酸成串，尤其是GGGG。

7、目前常用的引物和探针设计有Primer Express、Primer 3、Beacon Designer 2.0和NCBI。

实验步骤：
1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）
1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。
2）取100mg组织，加入到匀浆器中。
3）充分研磨直至无可见组织块。
4）12000rpm离心10min取上清。
5）加入250 μlCHCl₃，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
6）4℃ 下12000rpm离心10min。
7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。
8）-20℃ 放置15min。
9）4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。
11）4℃下12000rpm离心5min。
12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
13）加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。
14）55℃ 孵育5min。
15)使用UV1800检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5μl 待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
16）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl.左右。

2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）
1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。
2）加入1μl 逆转录引物。
3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。
4）于PCR仪上65℃ 保温5min，迅速置冰上冷却。
5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。
6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

3、定量PCR
1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
2× qPCR Mix12.5μl
7.5μM基因引物2.0μl
反转录产物2.5μl
ddH2O8.0μl

2）PCR扩增
预变性95℃，10min
循环（40次） 95℃，15s→60℃，60s
熔解曲线75℃→95℃，每20s升温1℃

4、结果处理
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)
B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)
K=A-B
表达倍数=2-K