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PCR实验干货推荐
314 人阅读发布时间：2024-04-16 14:13
PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称。是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。通过DNA基因追踪系统，能迅速掌握患者体内的病毒含量，其精确度高达纳米级别。
一、实验原理：
PCR聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列，其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸-变性-退火-延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链.
2. 退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.
3. 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
二、典型的PCR反应体系由如下组分组成：
①、DNA模板（template）：含有待扩增的DNA片段。
②、2条引物（primer）：决定了需要扩增的起始和终止位置。
③、DNA聚合酶（polymerase）：复制需要扩增的区域，耐高温的Taq 酶最为常见，其在DNA变性过程中仍具活性。
④、4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）：DNA聚合酶可以从中合成新的DNA互补链。
⑤、含有镁离子的缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。
三、 试剂仪器
①、试剂和缓冲液
PCR mix，10×PCR Buffer，引物，模板。
②、仪器耗材
PCR仪，掌上离心机，微量移液器，枪头，1.5mL离心管，PCR管，冰盒。
四、 实验步骤（每人一组，每人做1管，纯化时两人一组）
1. 查找基因序列，设计合成PCR引物。注意合成引物约需一周时间，请提前准备。详细步骤请参考实验一后面的附件内容。
2. 在50μL反应体系中，加入：
模板DNA (5ng/μL) 1
引物P1P2(10μmol/L) 各1
2×PCR mix 25
ddH2O 22
在冰上配制，注意混匀后离心。加入10μL石蜡油覆盖。
3. 在PCR仪中预变性94℃ 4min，然后循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；循环结束后，72℃10min 。扩增的PCR产物4℃保存。（OC-II）
4. 取PCR产物2-5μL与上样缓冲液混合，点样。
5. 1% 琼脂糖胶电泳，160V 30-40min。
6. 电泳结束，溴化乙锭染色5-10分钟。
7. 用凝胶成像仪观察、拍照。
8. PCR产物切胶回收。步骤参见胶回收Kit说明书。
一、实验原理：
PCR聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序列，其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后，将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这种延伸-变性-退火-延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。
1. 变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链.
2. 退火：使溶液温度降至50～60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.
3. 延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向复制出互补DNA。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
二、典型的PCR反应体系由如下组分组成：
①、DNA模板（template）：含有待扩增的DNA片段。
②、2条引物（primer）：决定了需要扩增的起始和终止位置。
③、DNA聚合酶（polymerase）：复制需要扩增的区域，耐高温的Taq 酶最为常见，其在DNA变性过程中仍具活性。
④、4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）：DNA聚合酶可以从中合成新的DNA互补链。
⑤、含有镁离子的缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。
三、 试剂仪器
①、试剂和缓冲液
PCR mix，10×PCR Buffer，引物，模板。
②、仪器耗材
PCR仪，掌上离心机，微量移液器，枪头，1.5mL离心管，PCR管，冰盒。
四、 实验步骤（每人一组，每人做1管，纯化时两人一组）
1. 查找基因序列，设计合成PCR引物。注意合成引物约需一周时间，请提前准备。详细步骤请参考实验一后面的附件内容。
2. 在50μL反应体系中，加入：
模板DNA (5ng/μL) 1
引物P1P2(10μmol/L) 各1
2×PCR mix 25
ddH2O 22
在冰上配制，注意混匀后离心。加入10μL石蜡油覆盖。
3. 在PCR仪中预变性94℃ 4min，然后循环：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30个循环；循环结束后，72℃10min 。扩增的PCR产物4℃保存。（OC-II）
4. 取PCR产物2-5μL与上样缓冲液混合，点样。
5. 1% 琼脂糖胶电泳，160V 30-40min。
6. 电泳结束，溴化乙锭染色5-10分钟。
7. 用凝胶成像仪观察、拍照。
8. PCR产物切胶回收。步骤参见胶回收Kit说明书。
五、注意事项
1. 进行PCR反应时，注意加入试剂的顺序。注意加入任何一种试剂后均需混匀。
2. 本实验使用2xPCR mix，包含有dNTPs和Taq酶。
3. 引物的稀释：分子量24bp*324.5 = 7788，质量数10OD*33 ＝33ug，摩尔数=33/7788 =4.2 nmol，母液浓度4.2 n mol / 84μL H2O = 50μmol/L，使用时取母液稀释5倍，则终浓度为10μmol/L。
4. PCR扩增产物共20μL，其中2-5 μL用于检测，剩余的用于纯化回收。
5. 使用自己的实验材料进行PCR扩增的学生，请提前准备引物和模板。