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实验室推选：PCR反应体系增加反应体系的灵敏度方法
人阅读 发布时间：2024-01-02 16:11
PCR 反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、 耐热 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板） 五部分组成。各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。这些组成主要分析如下：
一、缓冲液
任何一个生化反应都必须在一定的缓冲体系中进行，缓冲体系除了提供一定的pH缓冲能力外，还有一些有助于反应进行的成分。PCR反应缓冲液通常采用10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3-9.0，室温）缓冲液体系，其中含有可激活DNA聚合酶的活性中心的二价阳离子，一般采用Mg2+，以MgCl2的形式提供，Mg2+的浓度高低可显著影响 PCR扩增产物的特异性，此外，缓冲液中还含有50 mmol/L的K+，有利于引物与模板的退火。有些缓冲液中还加入明胶或血清白蛋白（100 μg/mL）及去污剂（如Twcen20 等），对Taq DNA聚合酶起稳定作用。
二、模板
PCR模板是含有待扩增序列的 DNA、mRNA或cDNA等，模板数量可直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR扩增，104～107个模板分子可达到满意的效果，一般宜用纳克（ng）级的克隆DNA、微克（μg）水平的染色体DNA或102～105拷贝待扩增的DNA片段作为起始材料。除了数量外，模板的质量也非常重要，不能有太多的蛋白质和其他污染，特别是其他DNA的污染，即使是痕量的DNA，也会导致非特异性产物。
三、dNTP
dNTP是dATP、dTTP、dGTP、dCTP的总称。贮备液为pH 7.0 左右，其浓度一般为20 mmol，-20℃保存。体系中为20~200 μmol即可，过低则反应速度下降，浓度过高则特异性下降，因为dNTP能络合溶液中的Mg2+，产生错配或抑制Taq DNA聚合酶活性。
四、耐热的DNA聚合酶
PCR反应中使用的 DNA聚合酶必须耐高温，在90℃以上的高温下仍能有活性，正是由于耐热DNA聚合酶的应用才使 PCR技术得以实现，目前使用的耐高温DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。
五、引物
PCR反应的最佳条件：
根据大量的研究报道，PCR反应的最佳条件为：
①Taq DNA聚合酶的浓度为1.0-2.5 U/100μL反应液；
②dNTP的浓度为20～200 μmol/L；
③Mg2+浓度为0.5～2.5 mmol/L；
④引物的浓度为0.2～1.0 μmol/L。在准备具体的PCR反应时，还要针对模板特性、PCR仪等进行上述反应体系的优化，并设置试验确定连退火温度、延伸时间，建立其相应的PCR反应最优程序。
RT-PCR实验反应体系增加反应体系的灵敏度方法详解：
1. 分离高质量RNA：
成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
2. 使用无RNaseH活性(RNaseH-)的逆转录酶：
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。
SuperScriptⅡ逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及thermoScript逆转录酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScripⅡ显著提高了长 RT-PCR产物的产量。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的 [α-P]dCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。
3. 提高逆转录保温温度：
较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用 ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物(GSP)进行cDNA合成时(见第三章)。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性(cDNA热启动合成)。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化 RT-PCR所需的多种温度切换。
Tth热稳定聚合酶在Mg2+存在条件下作为DNA聚合酶，在Mn2+存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65℃条件下保温。然而，PCR过程中Mn2+的存在会降低忠实性，这使得Tth 聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。
4. 促进逆转录的添加剂：
包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在SuperScriptⅡ逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4%，这不足以抑制PCR。
5. RNaseH处理：
在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅡ。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。
6. 小量RNA检测方法的提高：
当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250μg/ml。
在使用SuperScriptⅡ的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度，而且对于小量RNA，减少SuperScriptⅡ的量并加入40单位的 RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScriptⅡ进行逆转录反应时加入 BSA或RNase抑制剂。
一、缓冲液
任何一个生化反应都必须在一定的缓冲体系中进行，缓冲体系除了提供一定的pH缓冲能力外，还有一些有助于反应进行的成分。PCR反应缓冲液通常采用10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3-9.0，室温）缓冲液体系，其中含有可激活DNA聚合酶的活性中心的二价阳离子，一般采用Mg2+，以MgCl2的形式提供，Mg2+的浓度高低可显著影响 PCR扩增产物的特异性，此外，缓冲液中还含有50 mmol/L的K+，有利于引物与模板的退火。有些缓冲液中还加入明胶或血清白蛋白（100 μg/mL）及去污剂（如Twcen20 等），对Taq DNA聚合酶起稳定作用。
二、模板
PCR模板是含有待扩增序列的 DNA、mRNA或cDNA等，模板数量可直接影响扩增的效果。对于一般的 PCR扩增，104～107个模板分子可达到满意的效果，一般宜用纳克（ng）级的克隆DNA、微克（μg）水平的染色体DNA或102～105拷贝待扩增的DNA片段作为起始材料。除了数量外，模板的质量也非常重要，不能有太多的蛋白质和其他污染，特别是其他DNA的污染，即使是痕量的DNA，也会导致非特异性产物。
三、dNTP
dNTP是dATP、dTTP、dGTP、dCTP的总称。贮备液为pH 7.0 左右，其浓度一般为20 mmol，-20℃保存。体系中为20~200 μmol即可，过低则反应速度下降，浓度过高则特异性下降，因为dNTP能络合溶液中的Mg2+，产生错配或抑制Taq DNA聚合酶活性。
四、耐热的DNA聚合酶
PCR反应中使用的 DNA聚合酶必须耐高温，在90℃以上的高温下仍能有活性，正是由于耐热DNA聚合酶的应用才使 PCR技术得以实现，目前使用的耐高温DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶和Pwo DNA聚合酶等。
五、引物
PCR反应的最佳条件：
根据大量的研究报道，PCR反应的最佳条件为：
①Taq DNA聚合酶的浓度为1.0-2.5 U/100μL反应液；
②dNTP的浓度为20～200 μmol/L；
③Mg2+浓度为0.5～2.5 mmol/L；
④引物的浓度为0.2～1.0 μmol/L。在准备具体的PCR反应时，还要针对模板特性、PCR仪等进行上述反应体系的优化，并设置试验确定连退火温度、延伸时间，建立其相应的PCR反应最优程序。
RT-PCR实验反应体系增加反应体系的灵敏度方法详解：
1. 分离高质量RNA：
成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到 cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍/酸性酚的一步法。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品(如胰脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
2. 使用无RNaseH活性(RNaseH-)的逆转录酶：
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。
SuperScriptⅡ逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及thermoScript逆转录酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScripⅡ显著提高了长 RT-PCR产物的产量。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的 [α-P]dCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。
3. 提高逆转录保温温度：
较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用 ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物(GSP)进行cDNA合成时(见第三章)。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性(cDNA热启动合成)。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化 RT-PCR所需的多种温度切换。
Tth热稳定聚合酶在Mg2+存在条件下作为DNA聚合酶，在Mn2+存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65℃条件下保温。然而，PCR过程中Mn2+的存在会降低忠实性，这使得Tth 聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。
4. 促进逆转录的添加剂：
包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20%的甘油而不降低活性。为了在SuperScriptⅡ逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10%的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4%，这不足以抑制PCR。
5. RNaseH处理：
在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅡ。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。
6. 小量RNA检测方法的提高：
当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250μg/ml。
在使用SuperScriptⅡ的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度，而且对于小量RNA，减少SuperScriptⅡ的量并加入40单位的 RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScriptⅡ进行逆转录反应时加入 BSA或RNase抑制剂。
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