细胞传代培养（消化法）具体操作：

一、传代前准备：

　　1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

　　2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

　　3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。

　　4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。

　　5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。

　　6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

　　7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。

　　8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。

二、胰蛋白酶消化；

　　1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。

　　2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。

　　3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。

三、吹打分散细胞：

　　1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

　　2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。

　　3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6～8分钟。

　　4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

四、分装稀释细胞：

　　1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。

　　2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。

五、继续培养：

　　用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。

传代细胞培养注意事项：

　　1.严格的无菌操作

　　2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

　　附：EDTA（0.02％乙2胺四乙酸2钠）消化液配方：

　　EDTA0.20g，NaCl8.00g，KCl0.20g，KH2PO40.02g，葡萄糖2.00g，0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容至1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。