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ELISA实验中标曲和样本显色问题浅析
人阅读 发布时间：2023-12-05 13:36
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
在检测时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体反应。洗涤后加入酶标记的抗体，通过反应结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
ELISA是免疫学研究中最常用的实验方法之一。ELISA过程中常出现的各种问题，下面浅析ELISA实验中标曲和样本显色问题：
溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。标准品溶解时，需要涡旋震荡，以保证充分溶解。在做倍比稀释时，也要涡旋震荡以保证充分混匀。单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。
二、标曲和样本均不显色
在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。
三、标曲显色，样本不显色
遇到这种情况，很多人觉得是试剂盒问题，这其实是一个误区。任何一种实验方法，都有其局限性，当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。如采用信号增强剂的高敏ELISA、ECL为底物的化学发光ELISA、采用荧光法检测的ELISA、结合PCR扩增的免疫PCR等等。
对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，甚至低于标准品浓度最低的S7点，虽然可以计算得到数值，但实际上这个数值的可信度已经降低了。而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。需要指出的是，国内某些所谓的高敏ELISA试剂盒，并没有采用信号增强剂的方法，而只是简单地提高了抗体浓度，较普通ELISA其灵敏度的提升有限。
还有人觉得，为什么用其它厂家的试剂盒可以测到样本值，而我们的就是测不到呢？这里就涉及到回收率这个概念了，详细的阐述下次有机会可以跟大家再聊一聊。简单来说，回收率就是样本的真实值和理论值之间的比值，优秀试剂盒的这个数值在80 – 120%之间。与回收率相关的试剂就是试剂盒中的标准品稀释液。筛选出合适的标准品稀释液，使目的蛋白含量接近的标准品和样本显色速度相似，那么计算得到的样本值也会比较接近真实值。要想测到样本值并不是很难，只要选择合适的标准品稀释液，压低标曲的本底，自然就会计算得到样本值，然而这样的样本值并不真实，对于科研来说没有太大的参考意义。
四、标曲和样本都显色，但复孔的CV大
这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大。实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。大家可以参考关于移液器使用的文章，正确使用和维护移液器。个人的操作可以在空白板上练习移液动作，或者在几十个离心管中加入相同体积的水，通过电子天平称量，检验移液的精密度。同时还需练习加快加样速度，减少从第一个样本到最后一个样本加样时间过长导致的差异。
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