PCR 反应体系由反应缓冲液（10×PCR Buffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、 耐热 DNA 聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA 模板） 五部分组成，各个组份都能影响 PCR 结果的好坏。

1、反应缓冲液：一般随 Taq DNA 聚合酶供应。标准缓冲液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl
（pH8.3 室温），1.5mM MgCl2。Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物减少。在各种单核苷酸浓度为 200μM 时， Mg2+为 1.5mM 较合适。若样品中含 EDTA 或其它螯合物，可适当增加 Mg2+的浓度。在高浓度 DNA 及 dNTP 条件下进行反应时，也必须相应调节 Mg2+的浓度。一般 以 1.5-2mM（终浓度）较好。
2、dNTP ：高浓度 dNTP 易产生错误掺入，过高则可能不扩增；但浓度过低，将降低反应产物的产量。PCR 中常用终浓度为 50-400μM 的 dNTP。四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。此外，dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。因此，dNTP 的浓度直接影响到反应中起重要作用的 Mg2+浓度。
3、Taq DNA 聚合酶酶：在 100μl 反应体系中，一般加入 2-4U 的酶量，足以达到每 min延伸 1000-4000 个核苷酸的掺入速度。酶量过多将导致产生非特异性产物。但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对 PCR 反应影响极大，因此应当作
预试验或使用厂家推荐的浓度。当降低反应体积时（如 20μl 或 50μl），一般酶的用量仍不小于 2U，否则反应效率将降低。
4、 引物：引物是决定 PCR 结果的关键，引物设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR 反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：
⑴、引物的长度以 15-30bp 为宜，一般（G+C）的含量在 45-55%，Tm 值高于 55℃［Tm=4(G+C)+2(A+T)］。应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出
是随机的。
⑵、引物的 3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在 3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。3’端末位碱基在很大程度上影响着 Taq 酶的延伸效率。两条引物间配对碱基数少于 5 个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过 3 个由于影响引物设计的因素比较多，现常常利用计算机辅助设计。
⑶、人工合成的寡聚核苷酸引物需经 PAGE 或离子交换 HPLC 进行纯化。
⑷、引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。一般用 0.25-0.5pM/μl 较好。
⑸、引物一般用 TE 配制成较高浓度的母液（约 100μM），保存于-20℃。使用前取出其中一部分用 ddH2O 配制成 10μM 或 20μM 的工作液。
5、 模板：PCR 对模板的要求不高，单、双链 DNA 均可作为 PCR 的样品。虽然 PCR 可以 用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的 DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一 般还宜用μg 水平的基因组 DNA 或 104 拷贝的待扩增片段作为起始材料。原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、 Taq DNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白，将可能干扰 PCR 反应。

      PCR反应条件的选择技巧主要体现在温度、时间和循环次数上，温度过高，延伸时间不够都会对实验结果有很大的影响。PCR反应条件三要素为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性)。

1、变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。

2、退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
　　　　　复性温度=Tm值-(5～10℃)
　　在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

3、延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
　　　　　　　　　　　高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增 10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
　　循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。