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血清的作用与筛选

人阅读 发布时间:2022-08-05 14:50

    细胞培养液中添加的血清有牛血清、马血清、人血清等,其中牛血清是最常用的血清,分为胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是从母牛破腹取出的胎牛中分离出的血清,价格昂贵。新生小牛血清是从刚出生的尚未哺乳的小牛中分离出来的血清,如厂家能做到这一点,新生小牛血清的质量与胎牛血清的质量相差不大。如小牛出生后已哺乳,从这种小牛中取出的血清中可能含有较多的生物活性物质,其质量明显不如前两种。血清,指血液凝固后,在血浆中除去纤维蛋白原及某些凝血因子后分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白原已被除去的血浆。在细胞培养中的主要作用事项如下:
1. 提供对维持细胞指数生长的激素,特别是基础培养基中没有或量很少的营养物,还包括一些主要的低分子营养物;
2. 提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调变它们所结合的物质活力;
3. 血清中含有一些微量元素,有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合,起到解毒作用;
4. 细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源;
5. 血清蛋白形成了血清的粘度,可以保护细胞免受机械损伤,特别是在悬浮培养搅拌时,粘度起到重要作用;
6. 抑制蛋白酶的作用,在贴壁细胞传代时可将剩余胰蛋白酶失活,从而保护细胞。 
   虽然我们对血清的功能清楚,但血清的成份非常复杂,时至今日对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识;其次血清都是批量生产,各批量之间差异很大,而且血清保存期至多一年,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,在细胞培养中避免不了要做血清筛选。
在实际筛选时,主要从血清外观和实验操作时细胞的生长状态进行。

从外观上:
1. 颜色:
根据血红蛋白含量的不同,胎牛血清可表现出黄色或红色,这个指标的意义在于能体现出采血过程的严谨规范程度。胎牛血清或多或少总有点溶血,因为胎牛血清凝血功能差,红细胞容易破裂;

2. 澄清度:
高质量的胎牛血清由于蛋白和脂类等物质含量低,表现为稀薄、清淡;

3. 血清沉淀:
血清中的沉淀是由纤维蛋白的凝聚产生,对血清质量没有影响,沉淀的产生原因跟加工生产方式、是否反复冻融密切相关,在实验操作中可能会对细胞观察产生影响。

从性能上:
1. 细胞形态,在进行血清筛选时首先观察细胞的生长形态是否产生明显变化,以及观察贴壁细胞的贴壁情况,细胞在不同血清培养中可能会出现形态上的差异;
2. 倍增时间,一般情况下会选择倍增时间短的血清,值得注意的是血清的影响会传至5代,在进行测试时,最好培养五代后进行计倍增时间的计算;
3. 克隆形成率,测试时一般选50100200个细胞进行平板克隆测试,平均5d左右换一次液,两周后染色计数,对比克隆形成情况。
血清的质量,种类及使用的浓度都有可能影响细胞的生长,而不同批次的血清支持细胞生长的能力也不同,尤其是对克隆细胞的生长,某些批次血清可能含有毒性或抑制细胞生长的物质。因此,在购买大量血清之前,必须对血清支持细胞生长能力进行检测,然后再大量购买质量好的同一批号的血清。
注意事项如下

1、需要长期保存的血清必须储存于-20℃ – 70℃ 低温冰箱中。4℃冰箱中保存时间切勿超过1 个月。由于血清结冰时体积会增加约10%,因此,血清在冻入低温冰箱前,必须预留一定体积空间,否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。
2、一般厂商提供的血清为无菌,无需再过滤除菌。如发现血清有悬浮物,则可将血清加入培养液内一起过滤,切勿直接过滤血清。
3、瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20℃ 至 -70℃ 低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。然后移入室温,待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与成分均一,减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻,这样因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。
4、热灭活是指56, 30 分钟加热已完全解冻的血清。加热过程中須規則搖晃均勻。此热处理的目的是使血清中的补体成分(complement)灭活。除非必须,一般不建议作此热处理,因为热处理会造成血清沉淀物显著增多,而且还会影响血清的质量。补体参与反应有:细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。
5、切勿将血清在37℃放置太久,否则血清会变得浑浊,同时血清中的有效成分会破会而影响血清质量。
6、血清中的沉淀物絮状物:主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成,这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除,也可不用处理。
显微镜下“小黑点”:经过热处理过的血清,沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”,常误认为血清受污染。一般情况下,此小黑点不会影响细胞生长,但如果怀疑血清质量,则应立即停止使用,更换另一批号的血清。


 

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