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平板克隆实验具体过程

发布时间:2021-10-11 15:11 |  点击次数:

实验原理:
细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的重要技术方法。
当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆。其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率,表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。
贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆,而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性增殖能力两个重要性状。
平板克隆实验过程:
一、6孔板
1.将处于对数生长期的细胞胰酶消化后,完全培养基(基础培养基+10%胎牛血清)重悬成细胞悬液,并计数;
2.细胞接种:于6孔板培养板中各实验组接种400-1,000个细胞/孔(根据细胞生长情况确定,一般为700个细胞/孔);
3.继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止,中途每隔3天进行换液并观察细胞状态;
4.克隆完成后,在显微镜下对细胞进行拍照,然后PBS洗涤1次,每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min,PBS洗涤1次;
5.每孔加入结晶紫染液1ml,染细胞10-20 min;
6.PBS 洗涤细胞数次,晾干,数码相机拍照(分别对整个六孔板及每个孔进行单独拍照)。
         
注意事项:
1.每隔3天进行换液,在换液时,缓慢加入培养基,避免吹起细胞。
2.染色完成后,务必将染液清洗干净,不要在孔中有残留。
二、平皿
1.取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在完全培养基(基础培养基+10%胎牛血清)中备用。
2.将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组5个平行样。每组细胞每皿分别接种100个细胞于含10ml 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。
3.置37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周。
4.当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。
5.加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml,固定15分钟。
6.去固定液,加适量Giemsa应用染色液染10~30分钟
7.用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。
8.将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。
克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%
          

             

                                DU145细胞克隆形成的图片(相机左,显微镜右)

 

注意事项
平板克隆形成实验方法简单,适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
实验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大。
数据分析
显微镜下观察阳性克隆,即每个克隆>50个细胞,相机拍照,数克隆数(大小约在0.3-1.0 mm)计算克隆形成率,并统计克隆大小。