荧光定量PCR原理
荧光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

                      


荧光定量PCR中的对照：
对照的目的是对检测的各个环节进行监控，因此我们按照检测的流程对对照进行梳理。

常规荧光定量PCR的流程是：样品采集-运输-样品处理-核酸提取-反转录（RNA病毒）-扩增-结果读取。下面看看各个环节都可以使用哪些对照？

1.阳性对照和阴性对照

阳性对照和阴性对照是指在相同的处理条件下，比如一份已知的感染样品和一份已知的未感染样品，都进行了提取和扩增最终获得了阳性结果和阴性结果。阴阳性对照强调处理过程与样品一致，并且有明确的预期结果。

2.扩增对照

我们通常说的阳性对照和阴性对照指的是扩增试剂盒中附带的不需要提取的阳性对照和阴性对照，更准确的定义应该是扩增阳性对照和扩增阴性对照。扩增阳性对照含有阳性扩增模板，扩增阴性对照应含有阴性扩增模板（基质核酸）。扩增对照只能监控每次扩增过程中的扩增系统是否正常，不能监控采样、提取和每份样品的操作过程。如果是检测RNA样品的检测试剂盒，其扩增阳性对照使用质粒，便无法监控反转录过程。

3.内标（Internal Control，IC）

内标是指在同一反应管中与靶序列共同扩增的一段非靶序列分子。内标有两种形式，一种是使用天然样品中含有的内参基因作为内标，另一种是人工添加的内标。内标的最大特点是与靶序列共同扩增，而其他的对照都是独立扩增。

3.1 内参基因

通常它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。内参基因通常是持家基因（house-keeping gene）因为其表达水平受环境因素影响较小，而且在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达变化很小。常用的内参基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。

内参基因的优点是与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序，可以监控采样，运输，核酸提取和扩增的全部过程。缺点是不同物种，不同生理状态下，不同组织中的内参基因存在一定的差异。如果样品类型是口腔液，咽拭子等样品，内参基因的量很低可能导至实验不成立。如果检测的是环境样品则内参基因可能完全失效。

3.2 人工内标

添加一种不会干扰靶序列扩增的人工合成的内标。现在国外的诊断试剂盒大部分都会将内标直接添加在反应液中与模板一起扩增，但是这样的内标不能监控采样，运输和核酸提取的过程。

还有另一种形式的内标，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份样品中加入等量的内标，这样就可以监控样品的提取到扩增的过程。但是由于是人工添加到样品中，仍然不能监控胞内细菌病毒的释放情况。

4. 核酸提取对照

可以使用内参基因，假病毒混合基质，灭活病毒混合基质来监控提取到扩增的流程。

5. 反转录对照（RT control）

可以使用提取好的RNA内参基因，RNA假病毒混合基质，灭活RNA病毒混合基质来监控反转录到扩增的流程。

无反转录对照（no-RT control）含有除反转录酶以外的所有成分。
          

6. 空白对照（Blank control）

6.1无模板空白对照

NTC是指不含有模板（阳性模板或者阴性模板）的对照。目前的试剂盒的NC一般都是水或阴性缓冲液，所以NC等同于NTC。其实两者有不同的作用。

6.2仪器空白对照

NTC是含有引物探针和反应液主要监控引物探针，反应体系有没有被污染。这里的仪器空白对照我通常使用的是空反应管来监控仪器有无非特异性的荧光信号。

6.3荧光染料对照

最常使用的是ROX染料，由于荧光定量PCR的荧光信号在每个样品孔会有微小的差异所以使用特定的ROX荧光染料，系统可以根据ROX荧光染料的信号值来校准每孔的荧光信号。

7.质控品（Quality control, QC）

上述环节中使用的各种对照大部分是试剂厂家匹配试剂盒使用的产品，有的是实验室自制，所以整个的监控过程可能存在不够客观和独立。因此在实验室的对照设置中每次检测都建议使用第三方质控品，有条件的使用国家有证标准物质(Reference material ,RM)。由于标准物质具有准确量值和计量溯源性，可以更准确的评估整个试验流程的准确度。

8.定值参考品

医学上的定量检测试剂盒，需要配套定值参考品用于试剂盒的定量检测使用。

三、对照的选择

从上文可知没有一种对照是完美的，在检测中我们要根据自己的需求来进行灵活选择和搭配。笔者建议每一次检测时添加一个能对从提取到扩增环节进行监控的质控品或标准物质；每份检测样品中添加内标（如果样品种类比较多样建议使用人工内标，如果样品类型为相对固定的动物组织建议使用内参基因）；扩增阳性对照，扩增阴性对照，无模板对照和ROX对照。有条件的添加临床阳性对照和临床阴性对照，在怀疑提取环节或者反转录环节出现问题时使用核酸提取对照和反转录对照。不定期使用仪器空白对照。

1.阳性对照与污染

不可否认的一个事实是阳性对照可以增加实验室污染的风险。这种污染的来源一种是直接来源于扩增阳性对照的污染。对于扩增阳性对照来说通常10000拷贝/微升（CT值约25）是比较理想的，但是有一些试剂盒厂家的扩增阳性对照设置在CT值20以下，比大部分阳性样本都强。这么高浓度的对照给实验室带来了巨大的污染风险，原因可能仅仅是因为试剂厂家担心其阳性对照不稳定，长时间存放阳性对照降解。另一种污染来自于扩增产物的处理不当，或者实验室的设计布局不合理。

2.初筛和确诊

对照与实验目的的关系好像从来没有人提及过。根据笔者多年在检测实验室的经验，分享一点个人的心得，欢迎大家批评指正。

对于初筛实验，我们希望提高真阳性检出率，即提高诊断敏感性。我们需要检测系统达到最高检测效率，因此要在不同环节添加阳性对照，确保每个环节的检测效率最高。

对于确诊实验，我们希望提高真阴性检出率，即提高诊断特异性。我们需要确保检测系统不出现假阳性，因此要在不同环节添加阴性对照，减少非必须的阳性对照，甚至要在样品盘的不同位置中随机插入几个阴性对照，确保实验过程中没有被污染。