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上海博湖生物科技有限公司
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细胞冻存必须注意的事项
人阅读 发布时间：2021-07-13 16:43
细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。
原理
在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。
注意事项:
1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80~90%致密度。冷冻前检则细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
2.细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。
3.注意冷冻保护剂之品质。DISO应为试剂级等级，无菌且无色以0. 22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~ 10mI小体积分装，4C避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。
在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热里对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高参，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。
4.冷冻保存Z细胞浓度:
①normal human fibroblast : 1~ 3x 10'ce1ls/ml
②hybridoma: 1~3x 10*cells/m1,细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后DIE去。
③adherent tumor lines:5~ 7x10，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1~3x 10'cells/ml
④other suspensions:5~ 10X 10'cells/ml，human lymphocyte 须至少5X 10'cells/ml。
5.冻存可用10%~90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4 度时)，复苏存活率在80%~90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。
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