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细胞冻存必须注意的事项

发布时间:2021-07-13 16:43 |  点击次数:

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存,可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来,这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞,可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种,起到了细胞保种的作用。 

原理

在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内和外环境中的水都会形成冰晶,能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等,能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂,可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。
细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大。
目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞。

很多人觉得细胞冻存很简单,但是有些注意事项操作不好会影响或是损坏细胞的质量,冻存细胞的相关注意事项总结如下:
 
注意事项:
 
1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检则细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
 
2.细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。
 
3.注意冷冻保护剂之品质。DISO应为试剂级等级,无菌且无色以0. 22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~ 10mI小体积分装,4C避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。
 
在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热里对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高参,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。
 
4.冷冻保存Z细胞浓度:
 
①normal human fibroblast : 1~ 3x 10'ce1ls/ml
 
②hybridoma: 1~3x 10*cells/m1,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后DIE去。
 
③adherent tumor lines:5~ 7x10,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3x 10'cells/ml
 
④other suspensions:5~ 10X 10'cells/ml,human lymphocyte 须至少5X 10'cells/ml。
 
5.冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4 度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。