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公司新闻/正文
HK-2 细胞来源及细胞培养实验材料
4390 人阅读发布时间：2018-07-24 10:12
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 HK-2 细胞来源及细胞培养
HK-2 细胞由中山大学中山医学院高血压研究所王蔚东教授提供。细胞接种于25cm2无菌培养瓶中，用含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基在 37℃、5% 二氧化碳 CO2条件下培养，每隔1天进行1次细胞传代，取对数生长期的细胞进行实验。
1.1.2 药物与相关试剂
细胞培养用的 DMEM/F12 培养基、胰蛋白酶及胎牛血清购自 Gibco 公司，丙酮醛（购自上海源叶生物科技有限公司）（纯度≥ 95%），CCK-8 细胞计数试剂盒（购自同仁化学研究所） ，Rh123 及 DAPI 染色液（购自 Sigma 公司），Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、p-ERK1/2、GAPDH 抗体（购自Cell Signaling Technology 公司） 。
1.2 实验仪器
蛋白电泳仪及细胞培养箱（Bio-Rad 公司） ， 荧光倒置显微镜 （Olympus 公司） ， 酶联免疫检测仪 （ThermoFisher Scientific 公司） 。
1.3 方法
1.3.1实验分组
实验分组 ： 对照组（只加正常培养基）、丙酮醛组（加入400 μmol/L 丙酮醛处理 24 h）、丙酮醛 + 不同浓度 NAC 组 [400 μmol/L丙酮醛与不同浓度NAC（1、2、4 及 8 mmol/L）共孵育 24 h]。
1.3.2CCK-8 法检测细胞生长活力
取处于对数生长期且生长状态良好的细胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化后，按 2×108个 /L 的细胞密度接种在 96 孔板中。根据实验分组给予不同药物处理，每组设置 5 个平行复孔。细胞培养 24 h 后，弃上清液，每孔加入 100 μl含 10% CCK-8 的无血清培养基，在 37℃、5% CO2培养箱中孵育 1.5 h，用酶标仪在波长 450 nm 处测定吸光度值（OD）。细胞活力（%）=（试验组 OD 值 -空白孔 OD 值）/（对照组 OD 值 - 空白孔 OD 值）×100%。
1.3.3DAPI 染色观察 HK-2 细胞核形态变化
取处于对数生长期且生长状态良好的细胞，用胰蛋白酶消化后，按 3×107个 /L 的细胞密度接种在 6 孔板中。按分组给予不同药物处理后，弃培养基，用4% 多聚甲醛固定10min，再用PBS漂洗3 遍后，然后加入终浓度为 1μg/LDAPI 染色液，37℃、5% CO2培养箱中避光孵育 20 min，吸除DAPI 染色液，再用 PBS 漂洗 3遍，荧光显微镜下观察并拍照。
1.3.4细胞线粒体膜电位检测
取处于对数生长期且生长状态良好的细胞， 胰蛋白酶消化后， 按 3×107个 /L的细胞密度接种在 6 孔板中，每组设置 3 个平行复孔。根据分组给予相应药物处理 24 h 后， 吸除培养基，用 PBS 清洗 2 遍，然后加入终浓度为 100 μg/L 罗丹明 123 的无血清培养基，37℃、5% CO 2 培养箱中孵育 30 min，用 PBS 漂洗 3 遍，荧光显微镜下观察并随机选取 10 个不重复视野进行拍照。同时重复 1 次上述实验，在染色完成后，PBS 漂洗 3 次，然后用不含EDTA 的胰酶消化收集细胞，离心，弃上清液，加入PBS 吹打混匀，流式细胞仪上机检测细胞内线粒体膜电位变化。
1.1 材料
1.1.1 HK-2 细胞来源及细胞培养
HK-2 细胞由中山大学中山医学院高血压研究所王蔚东教授提供。细胞接种于25cm2无菌培养瓶中，用含 10% 胎牛血清的 DMEM/F12 培养基在 37℃、5% 二氧化碳 CO2条件下培养，每隔1天进行1次细胞传代，取对数生长期的细胞进行实验。
1.1.2 药物与相关试剂
细胞培养用的 DMEM/F12 培养基、胰蛋白酶及胎牛血清购自 Gibco 公司，丙酮醛（购自上海源叶生物科技有限公司）（纯度≥ 95%），CCK-8 细胞计数试剂盒（购自同仁化学研究所） ，Rh123 及 DAPI 染色液（购自 Sigma 公司），Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、p-ERK1/2、GAPDH 抗体（购自Cell Signaling Technology 公司） 。
1.2 实验仪器
蛋白电泳仪及细胞培养箱（Bio-Rad 公司） ， 荧光倒置显微镜 （Olympus 公司） ， 酶联免疫检测仪 （ThermoFisher Scientific 公司） 。
1.3 方法
1.3.1实验分组
实验分组 ： 对照组（只加正常培养基）、丙酮醛组（加入400 μmol/L 丙酮醛处理 24 h）、丙酮醛 + 不同浓度 NAC 组 [400 μmol/L丙酮醛与不同浓度NAC（1、2、4 及 8 mmol/L）共孵育 24 h]。
1.3.2CCK-8 法检测细胞生长活力
取处于对数生长期且生长状态良好的细胞，用 0.25% 胰蛋白酶消化后，按 2×108个 /L 的细胞密度接种在 96 孔板中。根据实验分组给予不同药物处理，每组设置 5 个平行复孔。细胞培养 24 h 后，弃上清液，每孔加入 100 μl含 10% CCK-8 的无血清培养基，在 37℃、5% CO2培养箱中孵育 1.5 h，用酶标仪在波长 450 nm 处测定吸光度值（OD）。细胞活力（%）=（试验组 OD 值 -空白孔 OD 值）/（对照组 OD 值 - 空白孔 OD 值）×100%。
1.3.3DAPI 染色观察 HK-2 细胞核形态变化
取处于对数生长期且生长状态良好的细胞，用胰蛋白酶消化后，按 3×107个 /L 的细胞密度接种在 6 孔板中。按分组给予不同药物处理后，弃培养基，用4% 多聚甲醛固定10min，再用PBS漂洗3 遍后，然后加入终浓度为 1μg/LDAPI 染色液，37℃、5% CO2培养箱中避光孵育 20 min，吸除DAPI 染色液，再用 PBS 漂洗 3遍，荧光显微镜下观察并拍照。
1.3.4细胞线粒体膜电位检测
取处于对数生长期且生长状态良好的细胞， 胰蛋白酶消化后， 按 3×107个 /L的细胞密度接种在 6 孔板中，每组设置 3 个平行复孔。根据分组给予相应药物处理 24 h 后， 吸除培养基，用 PBS 清洗 2 遍，然后加入终浓度为 100 μg/L 罗丹明 123 的无血清培养基，37℃、5% CO 2 培养箱中孵育 30 min，用 PBS 漂洗 3 遍，荧光显微镜下观察并随机选取 10 个不重复视野进行拍照。同时重复 1 次上述实验，在染色完成后，PBS 漂洗 3 次，然后用不含EDTA 的胰酶消化收集细胞，离心，弃上清液，加入PBS 吹打混匀，流式细胞仪上机检测细胞内线粒体膜电位变化。